iD-Speech: Secuenciación del genoma de SARS-CoV-2

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“El estudio y la secuenciación del genoma de SARS-CoV-2 es la colaboración científica más grande de la historia”

El equipo de Microbiología de la Universidad San Francisco de Quito, presentó un compendio del trabajo que han realizado durante esta pandemia en el webinar: Secuenciación del genoma de SARS-CoV-2, organizado por iD-Core Biotechnology junto con microbios. A continuación, reunimos los criterios principales discutidos durante este interesante iD-Speech.

Anteriormente han existido otros virus mortales transmitidos por animales silvestres, tales como el Nipah, que quizá no lo recordemos pero sus estadísticas indican un 50% de mortalidad a pesar de su baja transmisibilidad, otros tipos de SARS tienen 10% de mortalidad mientras que el MERS 35%, por lo cual las enfermedades zoonóticas no es algo nuevo.

Bill Gates dijo que no es raro que tengamos este tipo de problemas en este tiempo debido a la colectividad del mundo y las prácticas riesgosas que se practica como la alimentación a partir de vísceras. Las zoonosis han sido siempre graves para la especie humana y esta es una de las más agresivas que ha vivido la humanidad.

iD-Speech: Secuenciación del genoma de SARS-CoV-2

Equipo de microbiología de la USFQ

Investigadores involucrados en la secuenciación del SARS-CoV-2. Tenemos a Paúl Cárdenas, PhD. Profesor y director del Centro de Bioinformática de la USFQ, Sully Márquez, jefa del Laboratorio de Virología y Cultivo Celular, Belén Padro y Juan José Guadalupe que participaron en la secuenciación y análisis bioinformáticos. Adicional también participaron Gabriel Trueba, Patricio Rojas y Verónica Barragán en la interpretación de resultados.

El virus: SARS-CoV-2

Después de realizar un análisis de genomas se encontró que los virus aislados de pangolines son los más cercanos al SARS-CoV-2 que está infectando a los humanos. Aunque esto no está claro, se cree que el primer reservorio fue un murciélago, que posteriormente se transmitió a un pangolín; esto se pudo dar en una simple interacción como que un murciélago portaría frutas y al caerse el pangolín se alimentó de las mismas.

Lee: COVID-19 y SARS-CoV-2 ¿Cuál es la diferencia?

El SARS-CoV-2 es un virus de ARN que tiene una tasa de mutación elevada (1000 veces más alta que otro organismo), por lo cual es posible observar cambios en el virus en cuestión de semanas. Estas mutaciones que va acumulando el genoma del virus, nos permite saber de dónde viene, concretamente el país exacto. La alta tasa de mutación también se puede deber a otras connotaciones como una activa multiplicación, en donde se puede hablar de la existencia de varios linajes diferentes a los iniciales.

¿Por qué el distanciamiento social es efectivo?

Para esto es necesario considerar “El paradigma de quasiespecies”, en donde se explica que cuando una persona se contagia de un virus dentro de una especie, hay mutaciones. Puede haber una diversidad de virus con distintas propiedades, tal vez algunas menos viables; pueden ser deletéreas o destructivas. Un virus siempre está produciendo esas mutaciones, por lo tanto cuando se habla de distanciamiento social, se busca que haya una baja transmisión de distintos genomas, es decir, se recibe una menor cantidad de virus.

También es posible que por medio de la recombinación de genomas de dos virus relacionados pero distintos, se produzcan virus quiméricos ya que la polimerasa “salta” de una célula a otra y copia de forma equivocada; esto pasó con el SARS-CoV-2 en su proceso de evolución.

En el genoma del virus encontramos dos subunidades:

S1 que es la región globular que hace contacto con el receptor AC2, el mismo que se encuentra en la célula y tiene una región de aminoácidos que posibilita el contacto y,

S2 que es la región que sostiene al gen globular y está involucrada en el ingreso del virus entre proteína y membrana, por lo tanto  es importante para fusionar la membrana del virus con la de la célula.

Lo interesante de SARS-CoV-2 es que tiene una inserción de varios aminoácidos que no está presente en otros virus relacionados a SARS y está asociado a un fenómeno de patinaje de hebra de ARN, que provoca la introducción de nucleótidos adicionales. Esta región es probablemente el resultado de una evolución positiva dada el momento de replicación masiva del virus en una especie. El virus de influenza que tiene alta virulencia, también adquiere nucleótidos que codifican aminoácidos parecidos; estos aminoácidos son blanco de una proteasa llamada furina, que se asocia a la superficie de células y fracciona a la proteína S2, dejando expuesta a la región hidrofóbica que invade a la membrana celular.

Estructura del genoma de virus

El SARS-CoV-2 es un virus grande, de 30000 pares de bases, con ARN en sentido positivo, es decir que puede ser traducido en el ribosoma. Codifica proteínas estructurales y no estructurales; dentro de las no estructurales existen dos ORF (Open Reading Frames): 1a y 1b que codifican para diferentes proteínas relacionadas con la replicación y transcripción viral; así como otras proteínas con funciones de proeteólisis, antagonistas de interferones y de  ubiquitinación. Por otro lado, este virus tiene una enzima que le permite corregir errores, por lo cual probablemente la taza de mutación observada es menor que la esperada.

Las proteínas estructurales son: S o de la espina, M, E y N. Las proteínas que se usan para el diagnóstico del virus son las del ORF 1a, 1b o S; aunque las proteínas E y N también han sido usadas con el mismo propósito.

Lee: La famosa carga viral del coronavirus

¿Para qué secuenciar el genoma del virus?

Las razones más importantes para hacerlo son las siguientes:

  1. Saber el origen de cada muestra: si el virus se importó al Ecuador, el análisis del genoma permite ver cómo ingresó y cuántas veces, también es posible rastrear el origen de cada muestra.
  2. Determinar variedades del virus circulante: inicialmente se había clasificado en dos clados en base a la información masiva obtenida. Ahora hay cuatro o cinco agrupaciones que se han obtenido por análisis filogenéticos. Con este conocimiento, se puede hacer inferencias en epidemiologia sobre qué cepas son más agresivas o más contagiosas.
  3. Saber si las vacunas que se están desarrollando van a ser efectivas en nuestra población: ya que muchos de los tratamientos que actualmente están en estudio evitan la entrada de la proteína S, pero si hay variedades o mutaciones, también habrá variedades antigénicas, por lo que cuando se desarrolle la vacuna, es importante que los anticuerpos que genere el cuerpo también reaccionen contra los antígenos de estas variantes (a mediano y largo plazo).

Lee: La “secuenciación del genoma” para todos

Estudio realizado en Quito

Se llevó a cabo un análisis del genoma del virus del primer paciente diagnosticado como positivo para SARS-CoV-2 en Quito. La muestra es de un lavado bronqueo-alveolar de un paciente de 57 años de origen holandés que presentó síntomas en la provincia de Sucumbíos y fue trasladado al Hospital Eugenio Espejo.

La muestra fue enviada con un inactivador de virus, que conserva los ácidos nucleicos pero no permita que esté activo en viales transportados a los laboratorios. Posteriormente, se colocó en la muestra un buffer de predigestión con proteinasa K, se realizó la extracción de ARN, purificación y conversión a cDNA el cual fue cuantificado con ayuda del equipo Qubit.

A partir del cDNA se hizo barcoding (colocar un código de barras en la muestra para detección de la misma) y secuenciamiento. Otro enfoque fue el de realizar una PCR multiplex previo al barcoding, mediante un tiling de amplicones para amplificar el material del virus. Para generar sets de primers solapantes se realizaron dos pools, con el fin de generar amplicones pequeños que se solapen entre ellos y cubran todo el genoma o la mayor parte de él.

Los resultados del enfoque de metagenómica fueron complicados de obtener e interpretar ya que existe mucho ARN, incluyendo el presente en la microbiota respiratoria o salivaria del paciente; por lo cual al realizar pools el trabajo se facilita.

Algunas consideraciones finales

El uso del equipo Nanopore tiene menos cobertura que un equipo de primera generación como Illumina; sin embargo este problema puede evitarse secuenciando menos muestras por cada corrida. Se llegó a una cobertura de más de 100X; es decir, que cada nucleótido fue secuenciado por lo menos 100 veces por lo que los resultados son fiables.

Este trabajo se considera como la colaboración científica más grande de la historia. La filogenia nos permite entender como los virus se distribuyen en tiempo y espacio, nos indica la genealogía del virus y se basa en la evidencia que se tiene sobre las secuencias genómicas. El producto principal es el árbol filogenético que muestra las relaciones entre ancestros y descendientes del virus. Se ha logrado separar en clados que cuentan sobre la historia evolutiva del virus.

Implicación médica: el fenómeno migratorio provocó una expansión rápida del virus, dejando una tasa de letalidad cruda del 5,48% que cambia constantemente y que no se podrá saber con certeza sino hasta varios años después, una vez que se confirme cuántas personas se infectaron por casos asintomáticos o leves y que no fueron diagnosticados.

Para mejorar los resultados y hacer un análisis epidemiológico, sería necesario secuenciar genomas de más pacientes contagiados de diferentes partes del país y así saber qué cepas están circulando en Quito y Guayaquil, además que es necesario realizar un análisis en sitios donde hay contagio comunitario y de gente que no sabe en donde se contagió.

Vuelve a ver el iDSpeech

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